詳解非洲豬瘟PCR儀檢測方法
更新時間:2021-11-11 點擊次數(shù):6388
采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測,樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室,避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備,實施現(xiàn)場消毒和廢棄物處理。檢測前樣品應在二級生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉,經(jīng)研磨破碎后加1l的0.01mol/LPBS(pH7.2)制成勻漿,經(jīng)10000r/min離心取上清;全血、血清樣品直接取1mL,置于1.5皿離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。
非洲豬瘟PCR儀病毒DNA提取方式:
1、DNA提取應在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進行,若使用其他等效的病毒DNA提取試劑,則按照試劑說明書操作。
2、待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示,取n個滅菌1.5l離心管,逐管編號。
3、每管加入200uLDNA提取液1,然后分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200uL,1份樣品換用1個吸頭,混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下,13000r/min離心10min。
4、盡可能吸取上清、棄去,吸頭不要碰到沉淀,再加入10uLDNA提取液2,混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下,2000r/min離心10s。
5、100℃干浴或沸水浴10min。
6、加入90uL無DNA酶的滅菌去離子水,13000r/min離心10min,上清即為提取的DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
非洲豬瘟PCR儀操作步驟:
1、在反應混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測區(qū)分別進行提取。
2、每個檢測反應體系需使用20uL實時熒光PCR反應液。充分混勻后分裝,每個PCR反應管20uL。轉(zhuǎn)移PCR反應管至樣品制備區(qū)。
3、反應管中分別加入提取的DNA溶液5L,使每管總體積達到25L,記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后,瞬時離心。
4、將加樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內(nèi),記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素(FAM)作為報告基團,小溝結(jié)合物(MGB)為淬滅基團,反應參數(shù)設置如下:預變性95℃/3 min;95℃/15s,52℃/10s,60℃/35s,45個循環(huán);在每次循環(huán)的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結(jié)束后,根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。
非洲豬瘟PCR儀檢測閥值設定原則:閥值線超過陰性對照擴增曲線的高點,且相交于陽性對照擴增曲線進入指數(shù)增長期的拐點,或根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。每個樣品反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。